探究非生理剂量雌激素对型糖尿病的治疗作
探究非生理剂量雌激素对Ⅱ型糖尿病的治疗作用
廖兴宇周玉冰李一辉张瑞
摘要：随着经济的高速发展和工业化进程的加速，糖尿病成为对人类健康威胁最大的疾病之一，其中，2型糖尿病（T2DM）占糖尿病患者90%以上。T2DM的病因和发病机制目前并不明确，目前的治疗方法无法根治，探究T2DM的的发病机制和寻找其新的治疗方式具有重要的学术价值和临床意义。数据表明，2型糖尿病（T2DM）的发病率具有明显的性别差异，其发病与性激素可能存在一定联系。同时有研究表明，在去卵巢雌鼠中进行雌激素替代治疗有良好的降糖效果，提示雌激素可以用于降低T2DM所造成的高血糖。本实验旨在探究非生理剂量雌激素对T2DM小鼠血糖的影响，阐述非生理剂量雌激素与降糖效果的量-效关系。此外，我们将雌激素与胰岛素联合使用，探究非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用。
一、立论依据
随着经济的高速发展和工业化进程的加速，非传染性疾病对人类健康的威胁正日益加剧。据国际糖尿病联盟（IDF）统计，年全球糖尿病患者为2.85亿，按此增长速度，预计到年全球将有近5亿人罹患糖尿病[1]。糖尿病已经成为继心脑血管病、恶性肿瘤之后影响人类健康的第三大因素。糖尿病（DM）是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病，其并发症高达多种。WTO于年根据病因学证据将糖尿病分4大类，即1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。其中，T2DM占糖尿病患者90%以上。年全国调查中T2DM患病率为10.4%，男性高于女性（11.1%比9.6%），T1DM及其他类型糖尿病少见[2]。糖尿病引发的一系列健康问题困扰着众多家庭和社会，而开展糖尿病的早期发现、诊断及治疗，减少糖尿病并发症的危害，就能有效降低糖尿病相关社会和经济负担。
T2DM的病因和发病机制目前并不明确，其显著的病理生理学特征为胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降，即胰岛素抵抗（IR），伴随胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌相对减少。目前临床针对T2DM的主要治疗方式有口服降糖药、注射胰岛素类药物和减重手术，但这三种方式的疗效十分有限且不能根治T2DM。因此，探究T2DM的的发病机制和寻找其新的治疗方式具有重要的学术价值和临床意义。
基于T2DM的发病率具有明显的性别差异，我们猜想其发病与性激素具有一定联系。查阅资料后，我们发现性激素与IR之间具有很强的相关性[3,4]。与同龄男性相比，绝经前女性表现出更低的IR，但是这种优势在绝经后由于体内葡萄糖稳态受到破坏而消失，部分原因便是雌激素的减少[5]。同时有研究表明，在去卵巢雌鼠中进行雌激素替代治疗有良好的降糖效果，其作用机制为雌激素与α雌激素受体（ERα）结合，激活Foxo1依赖的磷脂酰肌醇3-激酶AKT（PI3K/Akt）信号通路改善胰岛素敏感性和抑制肝糖异生[6]。但已有的研究并未阐明非生理剂量雌激素与降糖效果的量-效关系，我们的研究致力于非生理剂量雌激素对T2DM小鼠血糖的影响，期望找到ERα受体饱和时的雌激素浓度，即挖掘雌激素降糖作用的最大潜能，进一步推动雌激素临床治疗T2DM的进程。同时，我们发现在许多疾病的发生发展中，雌激素与胰岛素具有协同作用，如两者协同作用于子宫内膜癌细胞的凋亡等[7,8]。由此，我们考虑雌激素与胰岛素联合使用，探究非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用，从而为T2DM的临床治疗提供新的角度。
二、实验目的
探究非生理剂量雌激素对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响；
探究非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用。
三、实验内容
1.探究非生理剂量性激素的降血糖效应：
向雌、雄鼠分别注射性激素，性激素的注射量设为大于其生理浓度的梯度，测量注射前后小鼠血糖值，计算血糖变化量。
将各浓度性激素产生的效应与生理浓度产生的效应对比，得到非生理剂量性激素对小鼠的降血糖效应的大小。
此外，通过对实验数据进行处理，绘制血糖变化量关于性激素剂量的曲线，可以得到能引起小鼠最大降血糖效应的性激素剂量的的大致区间，后续实验可以进一步缩小范围得到更为准确的值。
2.探究性激素与胰岛素在降血糖时是否具有协同作用：
向实验组和两对照组的小鼠分别注射等量的胰岛素+性激素、胰岛素+芝麻油以及生理盐水+性激素，测量注射前后小鼠血糖值，计算血糖变化量。
将同时注射胰岛素和性激素的血糖变化量与单纯注射二者之一的小鼠血糖变化量之和进行比较，研究性激素与胰岛素在降血糖时是否具有协同作用。
四、实验思路
第一部分探究非生理剂量性激素对降血糖效应的影响，第二部分探究性激素与胰岛素在降血糖时是否具有协同作用，两部分均需要对小鼠注射胰岛素、性激素等，均需要测量小鼠血糖，实验结果亦均需要用血糖变化来表征，即两部分实验内容存在诸多类似之处，故可以设计在一个实验中进行。
整体的实验可以分为前期准备和正式实验两个部分：
（一）前期准备
1.建立小鼠糖尿病模型
本实验旨在探究性激素的非生理剂量性激素对降血糖效应的影响以及其与胰岛素合用是否存在协同作用，从而为Ⅱ型糖尿病及胰岛素抵抗患者的治疗提供思路与支持，因此，需要建立小鼠的Ⅱ型糖尿病模型。
对于小鼠的Ⅱ型糖尿病模型，查阅相关资料后，我们拟选用db/db模型小鼠，这是Ⅱ型糖尿病及胰岛素相关研究的动物实验中的常用品系。db／db小鼠为广泛应用的2型糖尿病动物模型，由瘦素受体（1eptinreceptor，Lepr）的自发性突变引起极度肥胖、多食、消渴、多尿。针对db/db小鼠的为期20周的跟踪发现：①db／db小鼠体重、血糖和血清胰岛素水平比同龄对照组高（P〈0．01）；②db／db小鼠各脂肪系数明显大于db／＋小鼠（P〈0．01），而脾脏、胰腺以及肾脏则相对萎缩，特别是脾脏和雌性小鼠的胰腺与对照组相比差异极显著（P〈0．01）；③db／db小鼠肝细胞大片坏死、脂肪变性、炎细胞浸润、纤维组织增生；肾问质组织充血、水肿，肾小管内见蛋白管型、上皮细胞脂肪变性；胰岛数量明显减少、体积缩小，岛内细胞数量也相对减少。
2.切除性腺：
由于小鼠自身的性激素水平存在个体差异，为了排除内源性激素对实验结果的影响，在正式实验前应切除性腺。
3.持续注射性激素：
资料显示，每天注射一定量的性激素，持续四周，能够得到较理想的实验结果。
（二）正式实验
1.预先注射葡萄糖：
正式实验时，为防止小鼠因血糖过低而发生昏迷等现象，并且对小鼠血糖变化的测量需要其血糖具有一定程度的初始浓度，故在注射胰岛素前可先向小鼠注射等量适量的葡萄糖。
借鉴葡萄糖耐量实验，资料显示，针对小鼠，先禁食16小时，然后注射5g/Kg，20%的葡萄糖溶液比较合适。
2.分组处理：
对各小鼠进行分组，分别进行适宜的实验操作（详见“实验方案”）。
3.测量小鼠前后血糖：
在处理前后分别测量小鼠血糖。（详见“实验方案”）
测量仪器：罗氏血糖仪，需采血0.6μL/次；
采血方法：尾部针刺取血。
4.处理数据，分析结果：
计算各组小鼠处理前后血糖变化值，绘制相应曲线，得出结论（详见“预期实验结果”）。
五、实验方案
1.实验材料
（1）实验动物和分组
本实验选取12周龄db/db模型鼠16只，其中雌鼠8只，雄鼠8只，体质量20~25g，实验室光照时间08:00~20:00，室温控制在18℃~22℃，给予足够的饲料和水。随机将小鼠分为4组，①组③组雌鼠、雄鼠各3只，②组④组，雌、雄鼠各一只，均进行性腺切除手术：
①雌激素组：每日分别向雌鼠、雄鼠注射低、中、高三种浓度的17-β雌二醇；
②胰岛素组：每日注射雌二醇等量的芝麻油，正式实验时注射胰岛素；
③雌激素+胰岛素组：每日注射低、中、高三种浓度的17-β雌二醇，正式实验时注射胰岛素；
④空白对照组，颈后部皮下注射0.1ml芝麻油。
（2）试剂和药品
17-β雌二醇、纯芝麻油、戊巴比妥钠、碘伏、抗生素、胰岛素、葡萄糖。
2.实验方法
（1）卵巢切除手术
用1％戊巴比妥(80mg／kg)将小鼠腹腔麻醉，仰卧固定于手术台，1％碘伏消毒2遍，取腹正中切口，切开皮及肌肉层1~1.5cm，用镊子深入切口处，可拽出一发亮的脂肪团，其内可见双角管状子宫，沿子宫可找到卵巢，为深红色，将双侧卵巢结扎摘除止血，再将牵拉出的输卵管及子宫轻轻放回腹腔，逐层缝合腹肌和皮肤，术后肌肉注射少量抗生素。
（2）睾丸切除手术
腹腔注射1%戊巴比妥钠80mg/kg进行全身麻醉。仰卧固定，用手指按压腹部使睾丸进入阴囊内。阴囊周围消毒后,在阴囊正中部位做1cm切口,暴露包膜,用小镊子钝性分离睾丸及附睾外包膜，暴露睾丸、附睾及周围脂肪组织,分离睾丸动脉和精索动脉,结扎两动脉后切除睾丸。~U/kg青霉素冲洗腹腔后对阴囊皮肤进行缝合。
（3）给药方式
17-β雌二醇（对照组芝麻油）：雌二醇溶于0.1ml芝麻油中，每日颈后部皮下注射，持续四周
胰岛素（对照组生理盐水）：腹腔注射，正式实验时进行
葡萄糖：灌胃，5g/kg，20%浓度的葡萄糖
（4）采血及血糖测量
在未进行任何处理前和经过性激素（或芝麻油）、胰岛素（或生理盐水）处理后，分别测四组小鼠的空腹血糖和灌胃葡萄糖后（0、15、30、45、60min）血糖数据，统一测量血糖的处理方式：先将小鼠禁食16小时，测量空腹血糖，然后灌胃5g/kg，20%的葡萄糖溶液，测量灌胃后0、15、30、45、60min血糖数据。
采血方式：需要的血较少，采用尾部针刺取血法，使用血糖仪检测。
3.实验步骤及技术路线
（1）将雌鼠和雄鼠分组，分别标记性别和序号，切除雌鼠的双侧卵巢和雄鼠的睾丸，手术后在实验室光照时间08:00~20:00，室温控制在18℃~22℃，给予足够的饲料和水的条件下正常培养一周。一周后测量此时的空腹血糖和灌胃葡萄糖后（0、15、30、45、60min）血糖水平，绘制相应曲线。
（2）每天同一时间分别向实验室和对照组小鼠颈后部皮下注射性激素和等量芝麻油，持续四周：
①雌激素组：分别向雌鼠颈后部皮下注射10μg/kg/d、20ug/kg/d和30ug/kg/d的17-β雌二醇，雄鼠注射0.2μg/kg/d、0.4ug/kg/d和0.6ug/kg/d的17-β雌二醇，溶于0.1ml芝麻油
②胰岛素组：颈后部皮下注射0.1ml芝麻油（正式实验时注射胰岛素）
③雌激素+胰岛素组：分别向雌鼠颈后部皮下注射10μg/kg/d、20ug/kg/d和30ug/kg/d的17-β雌二醇，雄鼠注射0.2μg/kg/d、0.4ug/kg/d和0.6ug/kg/d的17-β雌二醇，溶于0.1ml芝麻油（正式实验时注射胰岛素）
④空白对照组：颈后部皮下注射0.1ml芝麻油。
（3）培养4周后，开始正式实验。先将小鼠禁食16小时，采血测量性激素（或芝麻油）作用后的空腹血糖。
（4）给各组小鼠灌胃5g/kg，20%的葡萄糖溶液，之后立即向②组、③组小鼠腹腔注射1U/kg/d的胰岛素，①组、④组小鼠腹腔注射胰岛素等量生理盐水。在注射0min、15min、30min、45min和60min后分别采血检测各小鼠血糖水平，绘制相应曲线。
（5）分析实验结果
对比①组、④组小鼠的血糖变化情况，探究非生理剂量雌激素对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响；
比较①组、②组血糖变化量之和与③组小鼠血糖变化量的大小关系，探究非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用。
（详细分析见“预计实验结果”）
4.成员分工
六、可行性分析
（1）操作可行性
①性激素给药颈后部皮下注射，易于操作
②卵巢摘除/去势手术手术是否成功，手术后小鼠能否存活有待讨论，这与操作水平、实验室卫生条件有关，
③小鼠培养条件一般实验室条件即可，可行性高
④能否于机能实验学课上完成若前期准备工作完成后，正式实验仅需进行注射葡萄糖、胰岛素和采尾血、测血糖的步骤，预计时间和操作难度允许在课上完成。但若要进行前期准备工作，则无法在课上完成。
（2）仪器设施是否具备
血糖仪可于淘宝购买，小鼠固定器可于生物器材公司购买
（3）实验材料是否易于购买
db/db小鼠于生物公司购买，雌二醇于索莱宝购买。
（4）购买仪器、实验动物、试剂的预算人民币
血糖仪RMB
小鼠固定器/个
db/db小鼠RMB/只
雌二醇RMB/g
重组人胰岛素RMB/20mg
（合计RMB）
七、预估实验结果
从表格中，我们可以计算出三个数据，分别代表不同参数：
①（A1-A0）：给药处理前小鼠降糖能力；
②（B1-B0）：给药处理后小鼠降糖能力；
③令C=（B1-B0）-（A1-A0）：给药处理对小鼠降糖能力的影响。
1.探究非生理剂量雌激素是否能独立作为降糖药物
2.在①组中，分别计算雌鼠和雄鼠的血糖下降差，将C雌C雄分别与空白组的C空雌C空雄相对比，若C雌C雄分别大于C空雌C空雄，则说明非生理剂量雌激素能独立作为降糖药物，反之则不可以。
3.探究非生理剂量雌激素与降糖效果的量-效关系
（1）在①组中，分别雌鼠算出给药浓度为低的五个时段的C，取其中的最大绝对值为C1max，即低浓度雌激素处理对小鼠降糖能力的影响。中、高浓度处理组以此计算方法可的C2max和C3max，分别代表中、高浓度处理对小鼠降糖能力的影响。若C3max=C2maxC1max，则代表中浓度雌激素已经大于或等于最佳浓度。我们应在中浓度与低浓度的范围内进一步探寻降血糖作用最佳的雌激素浓度。
（2）在①组中，将上述计算方法用于雄鼠，得到D1max、D2max、D3max。比较三者大小，得出雄鼠降血糖作用最佳的雌激素浓度。
4.探究非生理剂量雌激素与降糖效果是否具有性别差异
（1）将C1max与D1max、C2max与D2max、C3max与D3max进行比较，若前者与后者明显不等，则基本可以说明非生理剂量雌激素与降糖效果具有性别差异。全部大于说明非生理剂量雌激素在雌鼠中的降糖效果更好；全部小于说明非生理剂量雌激素在雄鼠中的降糖效果更好。
（2）若前者与后者无明显差异，则说明非生理剂量雌激素与降糖效果不存在性别差异
5.探究非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用
（1）按照①组的计算方法，将②组的雌/雄小鼠降糖能力表示为Emax/Fmax，将③组的雌/雄小鼠降糖能力表示为G1max、G2max、G3max和H1max、H2max、H3max。若GC+E,则说明在雌鼠中，非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面具有协同作用。反之，二者不存在协同作用。
（2）若HD+F。则说明在雄鼠中，非生理剂量雌激素与胰岛素在降血糖方面是否具有协同作用。反之，二者不存在协同作用。
八、项目创新点
1.探究非生理剂量雌激素对于降血糖的功效，为糖尿病治疗手段提供新的思路。
2.探究非生理剂量雌激素与胰岛素是否具有协同作用，为糖尿病联合用药提供新的选择。
九、项目展望
本项目探索了非生理剂量雌激素是否存在直接或间接降血糖的功效，为糖尿病患者的治疗用药等提供一定的思路。同时，确定能否与胰岛素协同用药，为临床用药提供指导。在之后，若实验证明非生理剂量雌激素可以起到降血糖的作用，则可以做进一步的探索，使得整个项目更完整科学：①重复实验，增大实验小鼠的数量，减少整个实验的误差②可深入研究其具体机制，设计能够与雌激素发挥相似降糖效果的药物而无需出现由于激素治疗而出现的一系列副作用。③可以继续探究出合适的雌激素浓度区间，为之后糖尿病激素治疗的浓度选择提供依据，之后可以进一步细化浓度区间，最适合的雌激素含量。④探索雄激素对于糖尿病降糖是否具有类似效应。
参考文献
1.中华医学会糖尿病学分会,中国2型糖尿病防治指南(年版).中国实用乡村医生杂志,(6):p.1-9.
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